實驗目(mù)的

　　為了(liǎo)獲(huò)取能與岩沙(shā)海葵毒(dú)素(sù)(Palytoxin，PLTX)特異(yì)性結合的(dí)天然適配體(tǐ)，目(mù)標(biāo)細(xì)胞內(nèi)提(tí)取得到(dào)的(dí)基(jī)因組通過超(chāo)聲(shēng)打斷(duàn)的(dí)方式變成 100-300 bp 的(dí) DNA 片段(duàn)，再(zài)通(tōng)過冷淬(cuì)的方式獲(huò)得折疊後(hòu)的 ssDNA。將(jiāng) ssDNA 進行(háng)甲(jiǎ)基化(huà)修飾(shì)後進行(háng)測(cè)序，同時對(duì)甲基化(huà)修飾後的片段進行親和力(lì)測(cè)定，最終(zhōng)獲(huò)得(dé)特異性(xìng)強(qiáng)，親和力高的天(tiān)然適配(pèi)體。

實驗步驟(zhòu)

　　HaCaT 和(hé) CHO-K1 細(xì)胞基因組 DNA 的提取
：

　　①常規培(péi)養細胞(bāo)，待(dài)其(qí)融合度達到 70% - 80%左右時，吸(xī)除(chú)原培(péi)養(yǎng)基，向(xiàng)每 10 cm2的(dí)貼壁細胞中加入(rù) 1 mL PBS，用移液槍(qiāng)吹落(là)細胞(bāo)，轉(zhuǎn)移至(zhì) 1.5 mL EP 管(guǎn)中(zhōng)，5000 rpm 離(lí)心(xīn) 5 min，棄(qì)上清，加入(rù) 200 μL 的(dí) PBS 重(zhòng)懸細胞;

　　②按(àn)照 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit 說明，加入 180 μL Buffer GB，20 μL Proteinase K 和(hé) 10 μL RNase A，充分吹(chuī)打混匀(yún)，於(yú) 56℃水(shuǐ)浴(yù) 10 min;

　　③向(xiàng)裂解(jiě)液(yè)中加入(rù) 200 μL 100%乙(yǐ)醇(chún)，充分吹(chuī)打(dǎ)混(hùn)匀後，將(jiāng)其(qí)轉移(yí)至(zhì)已經(jīng)安置(zhì)於(yú) Collection Tube 上的(dí) Spin Column 內，12000 rpm 離心 2 min，棄(qì)濾液(yè);

　　④將 500 μL Buffer WA 加入至(zhì) Spin Column 中，12000 rpm 離心(xīn) 1 min;

　　⑤將 700 μL Buffer WB 加入至(zhì) Spin Column 中，12000 rpm 離心 1 min，並(bìng)重復 1 次;

　　⑥將 Spin Column 安(ān)置於 Collection Tube 上(shàng)，12000 rpm 離(lí)心(xīn) 2 min;

　　⑦將 Spin Column 安置於新的(dí) 1.5 mL EP 管(guǎn)上，在(zài) Spin Column 膜的中央(yāng)處加入(rù) 50-200 μL 已加(jiā)熱(rè)至(zhì) 65℃的 Elution Buffer，室溫靜(jìng)置(zhì) 5 min;

　　⑧12000 rpm 離心 2 min，洗脫 DNA;

　　⑨使用(yòng) NanoDropTM One 進行(háng)基因(yīn)組 DNA 定(dìng)量。

　　片(piàn)段化(huà)基因組 :將提取的基(jī)因組 DNA 放(fàng)置於(yú)SCIENTZ08-IIIC非(fēi)接(jiē)觸(chù)式超聲(shēng)波細(xì)胞粉碎機中，設置功(gōng)率80%，超(chāo)聲開(kāi)時間為 1 s，超聲(shēng)關(guān)時間(jiān)為 3 s，工(gōng)作總(zǒng)時間為(wéi) 150 min，溫(wēn)度(dù)為(wéi) 15℃，片段化(huà)基因(yīn)組 DNA。

　　核酸凝膠電泳 :利(lì)用(yòng)核(hé)酸凝膠電(diàn)泳(yǒng)檢(jiǎn)測 DNA 片(piàn)段(duàn)的大小(xiǎo)，核酸(suān)凝膠(jiāo)的配方為
：ddH2O 6.69 mL，40%聚丙烯酰(xiān)胺(àn) 1.31 mL，5×TBE 2.4 mL，10%過(guò)硫(liú)酸(suān)銨(ǎn)(Ammonium persulfate，AP)72μL，四甲基(jī)乙(yǐ)二胺(àn)(Tetramethylethylenediamine，TEMED)18 μL。在(zài)樣(yàng)品中(zhōng)加入 5×上樣(yàng)緩(huǎn)衝液，充(chōng)分混合均匀，將(jiāng)配(pèi)置(zhì)好(hǎo)的凝膠(jiāo)放於電(diàn)泳槽(cáo)中，加(jiā)入 1×TBE 電泳緩(huǎn)衝(chōng)液，垂(chuí)直拔出(chū)梳子(zǐ)，立刻用緩衝液(yè)衝洗加樣孔(kǒng)，將樣(yàng)品緩慢均匀(yún)加(jiā)入(rù)孔中，300 V 電泳 20 min，取出(chū)凝膠放置於水(shuǐ)平搖床(chuáng)，用 Gel-red 染(rǎn)色(sè)液避光(guāng)孵育 20 min，在凝膠(jiāo)成像(xiàng)儀(yí)中(zhōng)成像，檢(jiǎn)測 DNA 片(piàn)段大小(xiǎo)範(fàn)圍(wéi)。

實(shí)驗(yàn)結果

　　基因組來(lái)源的 ssDNA 文庫的(dí)評價

　　超聲(shēng)破(pò)碎基因組後(hòu)，利用核酸(suān)凝膠(jiāo)電泳檢測基因組(zǔ)片段大(dà)小(xiǎo)。如圖(tú)所(suǒ)示，DNA 片段長(cháng)度富集於(yú) 200 - 300 bp 之(zhī)間，當其(qí)猝冷(lěng)變性折(zhē)疊(dié)成(chéng)單鏈後(hòu)，ssDNA 長度則集中(zhōng)於 200-300 nt 之間(jiān)，從 HaCaT 和 CHO-K1 細胞來源(yuán)的(dí)基(jī)因組(zǔ)文庫(kù)中(zhōng)各(gè)取(qǔ) 18 nmol 的(dí) ssDNA 用於後續(xù)實驗。

結(jié)論

　　結(jié)論
：提(tí)取(qǔ)得到(dào)的細胞(bāo)基(jī)因組(zǔ)經(jīng)過(guò)超聲打(dǎ)斷後得(dé)到 200-300 bp 大(dà)小(xiǎo)的(dí)片段，可直接用(yòng)於(yú)高通量(liáng)測序(xù)，也(yě)可(kě)重硫酸鹽(yán)轉化後(hòu)用於甲(jiǎ)基(jī)化測(cè)序。