背景(jǐng)

　　脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，又稱(chēng)內毒素(sù)，為(wéi)革(gé)蘭氏陰(yīn)性(xìng)菌(jūn)細胞壁(bì)外壁的組成成(chéng)分(fēn)，可(kě)作用(yòng)於(yú)膜受體激活(huó)多種(zhǒng)細胞(巨噬細(xì)胞(bāo)，上(shàng)皮細(xì)胞，內皮細胞(bāo)等)信號轉導係統，促進(jìn)促炎(yán)細(xì)胞(bāo)因子(zǐ)和(hé)其他炎性介(jiè)質的合(hé)成及釋(shì)放，引(yǐn)發(fā)炎(yán)症(zhèng)反應(yīng)。客戶采(cǎi)用LPS誘導RAW264.7巨(jù)噬(shì)細胞建(jiàn)立體外(wài)炎(yán)症模(mó)型(xíng)，使用(yòng)超(chāo)聲(shēng)波細胞(bāo)粉碎(suì)機(jī)將蛋白及核酸(suān)從炎(yán)症細(xì)胞(bāo)中分離出來，從(cóng)基(jī)因，蛋白相對表達水(shuǐ)平方(fāng)麵(miàn)評估羊棲菜(cài)多酚(Hizikia fusiformis polyphenols，HFPs)的抗炎活性，為(wéi)其在(zài)新(xīn)型抑炎製劑的(dí)開發(fā)利(lì)用提(tí)供理論(lùn)依據。

材料(liào)與方(fāng)法

1.1羊棲菜(cài)多酚(fēn)的(dí)製備(bèi)

　　取(qǔ)幹(gān)燥羊(yáng)棲菜(cài)粉末，加入體積(jī)分數(shù)60%乙(yǐ)醇(chún)溶(róng)液，使(shǐ)用SCIENTZ-IID 超聲輔助浸(jìn)提(料液比1:20(m/V)，50℃，60min)，抽(chōu)濾後真空(kōng)減(jiǎn)壓蒸餾去除乙醇，獲羊(yáng)棲菜(cài)粗多酚溶(róng)液，依次采用(yòng)等(děng)體(tǐ)積石(shí)油醚，乙(yǐ)酸(suān)乙酯(zhǐ)分(fēn)級(jí)萃取，真空減壓(yā)蒸餾後凍(dòng)幹(使(shǐ)用(yòng) SCIENTZ-12N 過(guò)夜凍幹(gān))，獲得(dé)HFPs粉(fěn)末(mò)。測(cè)得HFPs粉(fěn)末(mò)總(zǒng)酚含(hán)量為23.67±0.24 mg/g。利用(yòng)無菌水配製(zhì)成(chéng)多酚母液，再以細(xì)胞培(péi)養液稀釋至(zhì)不同濃度，用於(yú)後(hòu)續實驗(yàn)。

1.2炎症細胞培(péi)養(yǎng)

　　使用(yòng)完全培(péi)養(yǎng)基(含(hán)10%(體(tǐ)積分數，下同)胎牛血(xiě)清(qīng)和(hé)1%青鏈黴素(sù)雙(shuāng)抗DMEM培(péi)養基)培(péi)養(yǎng)RAW264.7細胞，37℃，5% CO2培養，細(xì)胞融(róng)合(hé)度約(yuē)80%時進行傳代。然後分成(chéng)3組(zǔ)進(jìn)行(háng)培(péi)養:①陰性(xìng)對(duì)照組，僅(jǐn)加(jiā)入(rù)含(hán)10%胎牛(niú)血(xiě)清的DMEM培(péi)養基;②LPS陽(yáng)性對(duì)照(zhào)組，加(jiā)入含(hán)LPS (1μg/mL)和(hé)10%胎牛血(xiě)清的DMEM培養(yǎng)基刺激24 h;③HFPs+LPS組(zǔ)，經(jīng)含不(bù)同質(zhì)量(liáng)濃度(dù)(10，20，40，60，80，100，120，140，160，180，200，250，300，350μg/mL)HFPs和(hé)10%胎(tāi)牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養24h後，以含LPS(1μg/mL)和(hé)10%胎(tāi)牛(niú)血清的DMEM培養(yǎng)基(jī)刺(cì)激(jī)24h。

1.3RAW264.7細(xì)胞炎(yán)症相關基因相對表達量(liáng)的測(cè)定(dìng)

　　1.2中培養(yǎng)的三組(zǔ)細(xì)胞(bāo)培養結(jié)束後棄(qì)去(qù)培(péi)養液，用0.01mol/L，pH7.2的(dí)磷酸(suān)鹽緩衝液(yè)(phosphate buffered saline，PBS)清洗細胞(bāo)2次，每孔加入(rù)500μL TRIzol試劑，使(shǐ)用(yòng)SCIENTZ-IID加速破碎細胞(bāo)協(xié)助提取總RNA，超(chāo)聲(shēng)參數為:100W，1s開1s關(guān)，共1min，並將RNA逆轉錄為cDNA。以(yǐ)cDNA為(wéi)模板，采用(yòng)SYBR Green嵌合熒光法與引物(wù)進(jìn)行(háng)實時熒(yíng)光定量PCR。測(cè)定目(mù)的基因(IL-1β，IL-6，TNF-a，COX-2，iNOS)和(hé)內參(cān)基因次(cì)黃嘌呤磷酸(suān)核(hé)糖基轉移(yí)酶(méi)1(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase，hprt1)Ct值，采用(yòng)2-△△Ct法計算目的(dí)基因的相對(duì)表達量。

1.4MAPKs，NF-KB信號(hào)通(tōng)路(lù)關鍵蛋白相(xiāng)對表(biǎo)達量(liáng)測定

　　1.2中培養的三組(zǔ)細胞培養(yǎng)結束(shù)後棄去(qù)培養(yǎng)液(yè)，用(yòng)0.01mol/L，pH7.2的磷酸鹽(yán)緩(huǎn)衝(chōng)液(phosphate buffered saline，PBS)清洗細胞(bāo)2次，加(jiā)入(rù)200μL RIPA細胞(bāo)裂解(jiě)液，使(shǐ)用SCIENTZ-IID加速破碎(suì)細(xì)胞協助提(tí)取蛋(dàn)白(bái)質，超聲(shēng)參(cān)數為(wéi):100W，1s開1s關，共(gòng)1min，離(lí)心(xīn)(12000r/min，4℃)10min取上清液(yè)。采用(yòng)BCA蛋白(bái)質量濃度(dù)測定(dìng)試(shì)劑盒測(cè)定(dìng)各組蛋白濃度，用蛋(dàn)白上樣(yàng)緩衝液(yè)調整蛋(dàn)白質(zhì)量濃度為2mg/mL，95℃加熱10min使(shǐ)蛋(dàn)白(bái)變(biàn)性然後進(jìn)行(háng)十(shí)二(èr)烷基(jī)硫酸鈉-聚(jù)丙(bǐng)烯(xī)酰(xiān)胺凝(níng)膠(jiāo)電(diàn)泳分離;濕轉到(dào)聚偏(piān)二氟(fú)乙烯膜;5%(質量分(fēn)數(shù))脫脂奶(nǎi)粉(fěn)(TBST溶(róng)液配製)封閉1h;一(yī)抗4℃孵(fū)育12h;二(èr)抗(kàng)室(shì)溫(wēn)孵(fū)育(yù)2h;加入(rù)ECL試劑進行(háng)顯(xiǎn)色反應，測定(dìng)蛋(dàn)白(bái)條帶灰(huī)度(dù)值(zhí)。以β-actin為(wéi)內(nèi)參(cān)，目的(dí)蛋(dàn)白包(bāo)括(kuò)iNOS，p65，p-p65，p38，p-p38，JNK和(hé)p-JNK，分別以p-p38/p38，p-JNK/JNK，p-p65/p65表示(shì)相應(yīng)蛋白磷(lín)酸(suān)化(huà)水(shuǐ)平(píng)。

結(jié)果(guǒ)與分(fēn)析

01RAW264.7細胞(bāo)炎(yán)症(zhèng)相(xiāng)關(guān)基(jī)因相對表達(dá)量(liáng)的測定(dìng)結(jié)果

　　采用(yòng)實(shí)時(shí)熒(yíng)光定量(liáng)PCR測定HFPs對(duì)LPS誘導的(dí)巨噬細胞(bāo)中(zhōng)重要(yào)促炎細胞因子IL-1β，IL-6和(hé)TNF-a基(jī)因相對(duì)表達量(liáng)，以(yǐ)及(jí)炎(yán)症(zhèng)相關(guān)酶COX-2基因(yīn)相對表達量的影響。如圖(tú)1所(suǒ)示(shì)，LPS刺激不(bù)同時間後(hòu)，所有炎(yán)症介質(zhì)的mRNA表(biǎo)達水(shuǐ)平均顯(xiǎn)著提高(P<0.05)。HFPs對促炎細(xì)胞(bāo)因(yīn)子的(dí)抑製作(zuò)用與其劑量，LPS誘導時(shí)間及(jí)細胞(bāo)因子種(zhǒng)類相關(guān)。與(yǔ)LPS組(zǔ)相(xiāng)比，靜息狀態(tài)細胞經HFPs處(chǔ)理再(zài)經LPS誘(yòu)導(dǎo)12，24h後(hòu)，IL-1β和(hé)IL-6的(dí)基因相對表達量顯著下降;HFPs顯(xiǎn)著抑製LPS誘導(dǎo)3h後(hòu)TNF-a基(jī)因(yīn)的(dí)相對表達，而(ér)在LPS誘導(dǎo)6~24h的(dí)抑(yì)製作(zuò)用(yòng)總(zǒng)體不(bù)明顯。在(zài)LPS誘導(dǎo)24h，較低(dī)劑量HFPs(30，60μg/mL) 預處(chǔ)理(lǐ)對COX-2基因表達(dá)具有顯著(zhù)抑製(zhì)作(zuò)用(yòng)，但提(tí)高(gāo)劑量後該抑製效果消失，甚至出現(xiàn)反向促(cù)進作(zuò)用，120μg/mL HFPs預處(chǔ)理促使(shǐ)COX-2相對表(biǎo)達量(liáng)較LPS組顯著(zhù)上升(shēng)(P<0.05).

02MAPKs，NF-KB信號通路關鍵(jiàn)蛋白(bái)相對表達量(liáng)測定

　　1.2中培(péi)養的三組(zǔ)細胞(bāo)培(péi)養(yǎng)結(jié)束後棄去培(péi)養(yǎng)液(yè)，用0.01mol/L，pH7.2的磷酸(suān)鹽緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)(phosphate buffered saline，PBS)清(qīng)洗細(xì)胞(bāo)2次(cì)，加(jiā)入(rù)200μL RIPA 細胞裂(liè)解(jiě)液，使用(yòng)SCIENTZ-IID加速破碎細(xì)胞(bāo)協助(zhù)提取(qǔ)蛋(dàn)白質(zhì)，超(chāo)聲(shēng)參數為:100W，1s開1s關(guān)，共1min，離心(12000r/min，4℃)10min取(qǔ)上清(qīng)液(yè)。采(cǎi)用BCA蛋(dàn)白(bái)質(zhì)量(liáng)濃(nóng)度(dù)測定試(shì)劑盒(hé)測(cè)定各(gè)組(zǔ)蛋白濃度(dù)，用蛋(dàn)白(bái)上樣緩(huǎn)衝液(yè)調整(zhěng)蛋(dàn)白(bái)質量(liáng)濃度為2mg/mL，95℃加熱10min使蛋白變性然後進行十二(èr)烷(wán)基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝(níng)膠(jiāo)電泳分(fēn)離(lí);濕(shī)轉(zhuǎn)到(dào)聚偏二(èr)氟乙(yǐ)烯膜;5%(質量(liáng)分(fēn)數(shù))脫脂(zhī)奶粉(TBST溶(róng)液(yè)配(pèi)製)封閉(bì)1h;一(yī)抗(kàng)4 ℃孵育12h;二抗室溫孵育2h;加(jiā)入(rù)ECL試劑進行顯(xiǎn)色反應，測定(dìng)蛋白(bái)條帶灰(huī)度(dù)值。以β-actin為內參(cān)，目的蛋白包括iNOS，p65，p-p65，p38，p-p38，JNK和(hé)p-JNK，分(fēn)別以p-p38/p38，p-JNK/JNK，p-p65/p65表示相應蛋(dàn)白磷(lín)酸化(huà)水平。

總(zǒng)結

　　客戶(hù)采用LPS誘(yòu)導(dǎo)RAW264.7巨(jù)噬(shì)細胞建立體(tǐ)外炎(yán)症模型，使用超聲(shēng)波(bō)細胞(bāo)粉(fěn)碎機(jī)將蛋白(bái)及(jí)核酸從(cóng)炎(yán)症(zhèng)細(xì)胞中分離出(chū)來，從基因，蛋白相對表達水平方麵評估(gū)羊(yáng)棲(qī)菜(cài)多(duō)酚(Hizikia fusiformispolyphenols，HFPs)的(dí)抗(kàng)炎活性，為其在(zài)新型(xíng)抑炎製(zhì)劑的(dí)開(kāi)發(fā)利用(yòng)提(tí)供理論(lùn)依(yī)據。超(chāo)聲波細(xì)胞(bāo)粉碎機(jī)在整個(gè)實驗(yàn)中起到(dào)作(zuò)用(yòng)如(rú)下:

　　01輔助提(tí)取羊棲(qī)菜(cài)中多酚(fēn)組(zǔ)分，加(jiā)速多(duō)酚組(zǔ)分釋(shì)放(fàng)，縮短(duǎn)了(liǎo)提取(qǔ)進(jìn)程，後續(xù)通過凍幹步(bù)驟(zhòu)即(jí)可獲(huò)得羊(yáng)棲(qī)菜多酚粉(fěn)末(mò)，溶(róng)解(jiě)後(hòu)備(bèi)用;

　　02搭配TRIzol試劑對細胞(bāo)中(zhōng)總RNA進行提取(qǔ)，試劑中含有(yǒu)苯酚(fēn)，可(kě)加速細(xì)胞破碎(suì)和(hé)核(hé)酸釋放，還加(jiā)入(rù)核酸(suān)酶抑(yì)製物質(zhì)防止RNA降解(jiě)，PCR結果(guǒ)表明(míng)提(tí)取的RNA濃(nóng)度(dù)與純度(dù)較(jiào)好，可用於(yú)相關基因表達情(qíng)況的分(fēn)析(xī);

　　03搭配RIPA裂(liè)解液對(duì)細胞(bāo)中的蛋白質進行(háng)提取，大(dà)幅減(jiǎn)少原本冰(bīng)上(shàng)裂解所需時間(30 min)，試(shì)劑(jì)中含(hán)有的蛋(dàn)白(bái)酶抑製(zhì)劑可防止蛋(dàn)白降(jiàng)解，還含有磷(lín)酸(suān)酶抑製劑(jì)，防止(zhǐ)蛋白提取(qǔ)後的再修飾(shì)，更好測(cè)定(dìng)蛋白磷酸化狀態。