實驗目(mù)的(dí)

　　為了解(jiě)大鼠肺組織中炎(yán)症因(yīn)子蛋白表(biǎo)達(dá)情(qíng)況，需要(yào)將組織內(nèi)的蛋白盡(jìn)量釋(shì)放並收集，使用研(yán)磨(mó)和超(chāo)聲手段，對(duì)肺組織(zhī)進行匀(yún)漿和細胞破(pò)碎(suì)，最(zuì)終(zhōng)分離(lí)得到溶(róng)液中的(dí)蛋(dàn)白(bái)進行WB實驗(yàn)，從(cóng)而(ér)了解蛋(dàn)白(bái)表達情況。

實(shí)驗(yàn)步驟

　　取(qǔ)0.2 g大鼠(shǔ)右(yòu)肺組(zǔ)織(zhī)樣(yàng)本(běn)，切碎，取(qǔ)適(shì)量溶解並(bìng)混匀後的RIPA裂解液，使(shǐ)用(yòng)前(qián)加(jiā)入(rù)酶抑製(zhì)劑，在每100 mg右肺組(zǔ)織樣(yàng)本內加(jiā)入 1 mL 的(dí)RIPA裂解(jiě)液(yè)，後使用(yòng)SCIENTZ-24高通(tōng)量組織(zhī)研(yán)磨(mó)器將(jiāng)組(zǔ)織充分(fēn)研磨匀(yún)漿(jiāng)，於(yú)4℃的條件(jiàn)下裂(liè)解(jiě) 30～60 min，將(jiāng)裂解後(hòu)的組織置於(yú)SCIENTZ-1500F超聲(shēng)分(fēn)散(sàn)儀(yí)上破碎，用高(gāo)速離心(xīn)機(jī)10000 r/min 離心10 min，取(qǔ)上清(qīng)液(yè)。提取總(zǒng)蛋(dàn)白並利用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白(bái)濃(nóng)度(dù)，於100℃水(shuǐ)中(zhōng)煮5 min，使蛋白變性(xìng)後(hòu)，置(zhì)於(yú)冰(bīng)上使(shǐ)其(qí)驟冷，提取(qǔ)為實驗使用的蛋(dàn)白樣(yàng)本，置於-20℃冰(bīng)箱(xiāng)中冷(lěng)凍保(bǎo)存。使(shǐ)用(yòng)蒸餾(liù)水(shuǐ)清(qīng)洗(xǐ)幹(gān)淨灌(guàn)膠(jiāo)玻璃(lí)板(bǎn)，豎直放置使其自然晾幹。分別使用分離膠，5%濃(nóng)縮(suō)膠處(chǔ)理後(hòu)，將凝膠置(zhì)於電泳槽(cáo)進(jìn)行電(diàn)泳(yǒng)，電(diàn)泳結束(shù)後將(jiāng)蛋(dàn)白(bái)轉(zhuǎn)移到(dào)預(yù)先準備(bèi)的(dí) NC 膜上，製(zhì)備(bèi)轉(zhuǎn)膜“三明治(zhì)”，在(zài)電轉(zhuǎn)儀中轉膜(mó)結(jié)束(shù)後(hòu)，搖床(chuáng)洗膜，封閉液封(fēng)閉1～2 h倒掉(diào)封閉液，加(jiā)入(rù)稀(xī)釋(shì)的(dí)相應抗(kàng)體(tǐ)。在(zài)搖(yáo)床(chuáng)上4℃ 過(guò)夜，TBS-T洗(xǐ)膜3次(cì)，每次(cì)10 min，加(jiā)入二(èr)抗。二抗孵(fū)育(yù)結束後，於搖(yáo)床上(shàng)用(yòng)TBST洗膜(mó)5～10 min ×3次(cì)。加ECL工作液於印跡膜(mó)上(shàng)30～60 s，吸幹(gān)發光(guāng)液，置印跡膜於成(chéng)像(xiàng)分(fēn)析儀(yí)自(zì)動(dòng)成(chéng)像(xiàng)，軟(ruǎn)件ImageJ分(fēn)析(xī)蛋白(bái)條(tiáo)帶灰(huī)度(dù)值(zhí)。

實驗結(jié)果

　　各組大鼠(shǔ)肺組織中IL-17，IL-22，IL-10，IL-35蛋(dàn)白(bái)表達情況比較與空(kōng)白(bái)組比較(jiào)，模型組和(hé)假(jiǎ) 貼(tiē)組(zǔ)肺(fèi)組織中(zhōng) IL-17，IL-22蛋白相(xiāng)對表達量(liáng)均明(míng)顯升高(gāo)(P均(jūn)<0.05)，IL-10，IL-35蛋(dàn)白(bái)相對表(biǎo) 達(dá)量(liáng)均明顯降低(P均(jūn)<0.05) ; 與(yǔ)模型(xíng)組(zǔ)和(hé)假(jiǎ)貼(tiē)組(zǔ)比較(jiào)，地塞米(mǐ)鬆組，發(fā)酵(jiào)組，非(fēi)發(fā)酵(jiào)組肺(fèi)組織中IL-17，IL-22蛋(dàn)白相對表達(dá)量(liáng)均明顯降低(P均<0. 05)，IL-10，IL-35蛋(dàn)白(bái)相對表(biǎo)達(dá)量均明顯(xiǎn)升高( P均(jūn)<0.05) ; 地(dì)塞米鬆(sōng)組，發酵(jiào)組，非(fēi)發酵組間各(gè)指標比(bǐ)較差異均無統(tǒng)計學(xué)意(yì)義( P均>0.05)。