實驗目的(dí)

　　麥角(jiǎo)甾醇化學(xué)名(míng)為24β-甲基(jī)膽固醇-5，7烯(xī)-3β-羥(qiǎng)基(jī)，分(fēn)子式為(wéi)C28H44O。麥角(jiǎo)甾(zāi)醇是(shì)微生物(wù)細胞膜(mó)的重(zhòng)要組(zǔ)成(chéng)成(chéng)分(fēn)。抑製麥角(jiǎo)甾醇的(dí)生(shēng)物合成(chéng)是(shì)目(mù)前殺(shā)菌(jūn)劑(jì)的(dí)重(zhòng)要作用(yòng)機(jī)製(zhì)之一(yī)。真菌幹菌絲(sī)中麥角甾醇含量一般(bān)維持在2～24mg/g之(zhī)間，大部(bù)分在5mg/g左右。真菌(jūn)細(xì)胞(bāo)膜被一層厚實，堅韌(rèn)並具(jù)有彈(dàn)性的(dí)細胞(bāo)壁包(bāo)裹，對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作(zuò)用，必(bì)須將細胞壁(bì)破碎使胞(bāo)內物質(zhì)釋(shì)放才能進一步提取。因此(cǐ)，禾(hé)穀(gǔ)鐮(lián)孢菌細胞破(pò)碎(suì)是(shì)檢測(cè)麥角甾醇含量的關鍵步驟。目前(qián)，真(zhēn)菌(jūn)中(zhōng)主(zhǔ)要(yào)采(cǎi)用的(dí)是皂(zào)化法(fǎ)，超(chāo)聲波和微波3種(zhǒng)方法進(jìn)行細胞破(pò)碎，其中，皂化(huà)法(fǎ)存在(zài)提(tí)取(qǔ)時間(jiān)較長(cháng)，溫度高，有機(jī)溶劑使(shǐ)用量大，安全(quán)係(xì)數小(xiǎo)等(děng)缺(quē)陷;超聲波(bō)和微(wēi)波(bō)提(tí)取盡管省時(shí)，節(jié)能，高(gāo)效，但對(duì)於細胞壁(bì)較為堅(jiān)硬(yìng)的真(zhēn)菌(jūn)細胞(bāo)，破壁效(xiào)率(shuài)低，單(dān)獨使用難以(yǐ)達(dá)到(dào)理(lǐ)想的(dí)破壁效(xiào)果(guǒ)。因此，本研究擬建立超聲輔助(zhù)皂(zào)化法提取禾穀(gǔ)鐮孢(bāo)菌麥角(jiǎo)甾醇的方法，並利用HPLC進(jìn)行(háng)定量分(fēn)析(xī)，為(wéi)進一(yī)步研究(jiū)禾穀(gǔ)鐮孢(bāo)菌(jūn)的麥角甾(zāi)醇奠定基(jī)礎。

實(shí)驗(yàn)步驟

　　單因素(sù)試驗(yàn)及響應⾯優化試(shì)驗 :單因(yīn)素(sù)試驗:稱取(qǔ)禾(hé)穀鐮(lián)孢菌(jūn)粉(fěn)末(mò)，考察KOH含量(0.01，0.015，0.02，0.025，0.03和0.04g/mL)，超聲提(tí)取溫度(20℃，30℃，40℃，50℃和60℃)，液固(gù)比(20，40，100，200和(hé)400mL/g)及超聲(shēng)提(tí)取時(shí)間(5，10，15，20和30min)對禾穀鐮孢菌麥角(jiǎo)甾(zāi)醇提取量(liáng)的(dí)影(yǐng)響。響應(yīng)麵優化試(shì)驗(yàn)設(shè)計，在單因(yīn)素(sù)試(shì)驗(yàn)基礎上(shàng)，以(yǐ)麥角(jiǎo)甾醇(chún)提取(qǔ)量為(wéi)響應值，乙(yǐ)醇中鹼含量，提取溫(wēn)度(dù)，液固比和超聲提取時(shí)間為(wéi)自(zì)變量(liáng)進(jìn)行提取(qǔ)條(tiáo)件優化。

實驗結果

　　皂化過(guò)程中可通(tōng)過(guò)鹼(jiǎn)來(lái)解(jiě)離(lí)結合(hé)的(dí)麥角甾(zāi)醇(chún)，試驗采用(yòng)乙醇(chún)提(tí)取麥(mài)角甾(zāi)醇，因(yīn)此乙(yǐ)醇中鹼含(hán)量對於(yú)麥角甾醇的提(tí)取(qǔ)十分重(zhòng)要。通(tōng)過(guò)單因(yīn)素(sù)試(shì)驗提(tí)取(qǔ)麥角(jiǎo)甾醇(chún)結(jié)果見(jiàn)圖(tú)1。如圖1(A)所示，當(dāng)鹼含量(liáng)約為0.03g/mL，皂(zào)化效(xiào)果(guǒ)較好。植(zhí)物(wù)原(yuán)料中皂化溫度(dù)越(yuè)高(gāo)，麥角(jiǎo)甾醇(chún)的(dí)皂化(huà)效(xiào)率越(yuè)高，一(yī)般情況(kuàng)下，皂(zào)化溫(wēn)度越(yuè)高，皂化(huà)程(chéng)度越劇烈(liè)，超聲加速細(xì)胞(bāo)壁(bì)破壁，溶(róng)解，更(gēng)有(yǒu)利於皂化反應(yīng)的(dí)進行，通常(cháng)在(zài)70℃可(kě)完全(quán)皂化。圖(tú)1(B)所示(shì)超(chāo)聲輔(fǔ)助(zhù)後(hòu)，在(zài)40℃麥角(jiǎo)甾(zāi)醇(chún)提(tí)取量即(jí)可(kě)達到平(píng)衡，說明(míng)超(chāo)聲輔助皂化可(kě)以顯(xiǎn)著(zhù)降(jiàng)低(dī)皂化(huà)溫(wēn)度，降低皂(zào)化能耗(hào)。圖1(C-D)所(suǒ)示，當液固(gù)比和超(chāo)聲提(tí)取時間(jiān)增加(jiā)時，禾穀鐮(lián)刀菌中(zhōng)麥角甾醇的(dí)提取(qǔ)量(liáng)呈(chéng)現先增(zēng)大(dà)後減(jiǎn)小的(dí)趨勢;在液固萃取時，液(yè)固比不同(tóng)，液相(xiāng)，固相(xiāng)之(zhī)間(jiān)的濃度差(chà)就(jiù)不同，傳質推動力就會(huì)出現(xiàn)快(kuài)慢，影(yǐng)響提取(qǔ)效果(guǒ)。超聲(shēng)提取時(shí)間(jiān)的(dí)增加會(huì)增加(jiā)細胞破(pò)碎程度，使得(dé)麥角(jiǎo)甾(zāi)醇(chún)更(gēng)易(yì)於發生(shēng)皂化(huà)反應，皂(zào)化(huà)反(fǎn)應(yīng)完成後，超聲可(kě)能會破(pò)壞(huài)麥角甾醇(chún)結構，致使(shǐ)其(qí)含(hán)量(liáng)下降。因此(cǐ)綜合(hé)考(kǎo)慮(lǜ)提(tí)取量(liáng)，效率(shuài)，成本等各(gè)項(xiàng)因(yīn)素(sù)，選(xuǎn)擇KOH含量0.03g/mL，溫度(dù)40℃，液(yè)固(gù)比200mL/g，超(chāo)聲時間15min為(wéi)中(zhōng)心點(diǎn)進行響(xiǎng)應(yīng)麵分析試驗(yàn)。

圖1各因(yīn)素對(duì)⻨⾓甾(zāi)醇提取(qǔ)量(liáng)的影響(xiǎng)

實(shí)驗討論(lùn)

　　采用(yòng)超(chāo)聲(shēng)輔助皂化(huà)法提取麥(mài)角甾(zāi)醇，通過單因素和響應麵(miàn)優(yōu)化(huà)，對(duì)影響麥角甾醇提取效果的主要因素(sù)進行研究，並建(jiàn)立(lì)禾穀(gǔ)鐮孢菌(jūn)菌(jūn)絲中(zhōng)麥(mài)角甾醇的提(tí)取方法。結果(guǒ)表(biǎo)明，各因(yīn)素對麥(mài)角(jiǎo)甾(zāi)醇提取量的影(yǐng)響(xiǎng)程度依次為:鹼(jiǎn)含量>液固比>時(shí)間(jiān)>溫(wēn)度。最(zuì)佳提取條件為鹼含(hán)量(liáng)為0.034g/mL，溫度為(wéi)36℃，液固比為200mL/g，超聲提取時間8min，在(zài)該提(tí)取(qǔ)條件下，麥角甾(zāi)醇提取(qǔ)量高達0.88mg/g。該(gāi)方法(fǎ)綫性(xìng)範圍為3.125～200μg/mL，回收(shōu)率達(dá)到(dào)82%以(yǐ)上(shàng)，以其(qí)作為(wéi)小麥禾(hé)穀鐮孢菌固(gù)態(tài)發酵生物量(liáng)的指(zhǐ)標(biāo)，可信(xìn)度高，也可(kě)被借鑒於其他(tā)真菌(jūn)的相(xiāng)關研(yán)究(jiū)和(hé)應(yīng)用中(zhōng)。

[1]郭瑞,饒斌,吳(wú)琴燕,等(děng).超聲輔助皂(zào)化提取(qǔ)禾(hé)穀鐮孢菌(jūn)中麥角甾醇及其HPLC分析[J].分(fēn)析(xī)試(shì)驗(yàn)室,2019,38(11):1353-1358.DOI:10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2019.022006.