實驗(yàn)目的(dí)

為(wéi)了(liǎo)解大(dà)鼠肺組(zǔ)織(zhī)中(zhōng)炎(yán)症(zhèng)因子蛋(dàn)白表(biǎo)達情(qíng)況，需(xū)要(yào)將組織內的(dí)蛋(dàn)白盡(jìn)量釋放(fàng)並(bìng)收集，使用(yòng)研磨和超聲(shēng)手(shǒu)段，對(duì)肺組織進行(háng)匀(yún)漿和細胞破碎，最(zuì)終(zhōng)分離(lí)得(dé)到(dào)溶液中的蛋白(bái)進(jìn)行WB實驗，從(cóng)而了解(jiě)蛋白表達情況
。

實驗步(bù)驟(zhòu)

取0.2g大鼠右(yòu)肺組(zǔ)織(zhī)樣本，切碎，取(qǔ)適量(liáng)溶解並(bìng)混匀後的RIPA裂解(jiě)液，使用(yòng)前加(jiā)入(rù)酶(méi)抑(yì)製(zhì)劑(jì)，在(zài)每100 mg右肺組織樣本內加入(rù) 1 mL 的RIPA裂(liè)解液，後(hòu)使(shǐ)用(yòng)SCIENTZ-24高(gāo)通量組(zǔ)織研(yán)磨器(qì)將(jiāng)組織充分(fēn)研(yán)磨匀(yún)漿，於(yú)4℃的(dí)條件下裂解(jiě)30～60 min，將裂解(jiě)後的(dí)組(zǔ)織(zhī)置(zhì)於SCIENTZ-1500F超聲分散儀上破碎(suì)，用高速離(lí)心(xīn)機10000r/min離心10min，取上清液(yè)
。提取(qǔ)總蛋白並(bìng)利用BCA試(shì)劑盒測定總蛋白濃(nóng)度(dù)，於(yú)100℃水中煮5min，使蛋白變性後，置(zhì)於冰(bīng)上(shàng)使(shǐ)其驟(zhòu)冷，提(tí)取(qǔ)為(wéi)實(shí)驗(yàn)使用的蛋白樣本，置於－20℃冰(bīng)箱(xiāng)中(zhōng)冷(lěng)凍保存
。使用(yòng)蒸(zhēng)餾水(shuǐ)清洗幹(gān)淨(jìng)灌(guàn)膠玻璃(lí)板，豎(shù)直放(fàng)置(zhì)使其(qí)自(zì)然(rán)晾(liàng)幹
。分別使用(yòng)分離膠(jiāo)，5%濃縮(suō)膠(jiāo)處理後(hòu)，將凝膠置(zhì)於電泳(yǒng)槽進(jìn)行電(diàn)泳，電(diàn)泳結束後將蛋白轉(zhuǎn)移到(dào)預(yù)先準備的 NC 膜(mó)上(shàng)，製(zhì)備轉膜(mó)“三(sān)明(míng)治”，在(zài)電轉(zhuǎn)儀(yí)中轉膜結(jié)束後，搖(yáo)床(chuáng)洗膜(mó)，封(fēng)閉液封(fēng)閉1～2 h倒掉(diào)封(fēng)閉(bì)液，加入稀釋的相(xiāng)應抗(kàng)體(tǐ)
。在搖床上(shàng)4℃過(guò)夜，TBS－T洗膜(mó)3次(cì)，每(měi)次(cì)10 min，加(jiā)入(rù)二抗
。二(èr)抗(kàng)孵育結束(shù)後，於搖(yáo)床(chuáng)上用TBST洗膜5～10min×3次
。加ECL工(gōng)作(zuò)液(yè)於(yú)印跡膜上30～60s，吸幹(gān)發(fā)光(guāng)液(yè)，置(zhì)印(yìn)跡(jì)膜(mó)於(yú)成像(xiàng)分析儀(yí)自動(dòng)成像，軟件ImageJ分(fēn)析(xī)蛋白條帶(dài)灰(huī)度(dù)值
。

實驗(yàn)結果(guǒ)

各(gè)組(zǔ)大(dà)鼠(shǔ)肺組(zǔ)織中IL－17，IL－22，IL－10，IL－35蛋白(bái)表達情況比較與空白(bái)組(zǔ)比(bǐ)較(jiào)，模型(xíng)組和假 貼(tiē)組肺組(zǔ)織中 IL－17，IL－22蛋白相對表達量均(jūn)明(míng)顯升高(P均＜0.05)，IL－10，IL－35蛋白相(xiāng)對(duì)表(biǎo) 達量均明(míng)顯降(jiàng)低(dī)(P均(jūn)＜0.05) ; 與模型(xíng)組(zǔ)和假貼組(zǔ)比較，地(dì)塞米(mǐ)鬆組，發(fā)酵組(zǔ)，非(fēi)發酵組肺組(zǔ)織中IL－17，IL－22蛋(dàn)白相(xiāng)對表(biǎo)達(dá)量(liáng)均明(míng)顯降低(P均(jūn)＜0. 05)，IL－10，IL－35蛋(dàn)白相(xiāng)對表達量均明顯(xiǎn)升(shēng)高( P均＜0.05) ; 地塞(sāi)米(mǐ)鬆組，發酵組，非發(fā)酵(jiào)組(zǔ)間各(gè)指(zhǐ)標(biāo)比(bǐ)較差異(yì)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學意義(yì)( P均(jūn)＞0.05)
。

表1 空(kōng)白(bái)組(zǔ)和支(zhī)氣管(guǎn)哮喘各(gè)組(zǔ)大(dà)鼠(shǔ)肺組織中(zhōng)IL－17，IL－22，IL－10，IL－35蛋白相(xiāng)對表達量比較(jiào)(x±s)

圖一空白組和(hé)支氣管哮(xiào)喘各(gè)組大鼠(shǔ)肺(fèi)組織中(zhōng)IL－17，IL－22，IL－10，IL－35蛋白(bái)表達(dá)電泳圖(tú)