在發(fā)酵(jiào)工(gōng)程，合(hé)成(chéng)生物學及分子(zǐ)生(shēng)物學(xué)研(yán)究(jiū)中，釀酒(jiǔ)酵母(mǔ)(Saccharomyces cerevisiae)是(shì)重要(yào)的模式(shì)生物(wù)和(hé)工業菌(jūn)株。針對(duì)其開展的(dí)蛋白(bái)質組學(xué)分析(xī)，核(hé)酸(suān)提(tí)取(qǔ)，酶活(huó)性測(cè)定(dìng)及代謝(xiè)物檢測等實(shí)驗，均依賴於高效(xiào)，溫和的細胞破(pò)壁(bì)前(qián)處(chǔ)理。然而，酵母細胞壁結(jié)構(gòu)致密，含交(jiāo)聯(lián)β-葡(pú)聚(jù)糖(táng)和(hé)幾(jī)丁質，傳(chuán)統(tǒng)酶解(jiě)或機(jī)械方(fāng)法(fǎ)(如玻(bō)璃珠渦旋(xuán))存(cún)在破壁效(xiào)率低，易產(chǎn)熱導致生物分子(zǐ)降(jiàng)解，處理通量低(dī)且重(zhòng)復性(xìng)差(chà)等(děng)痛點(diǎn)。

　　本實(shí)驗(yàn)采(cǎi)用新(xīn)芝生(shēng)物(wù)冷凍型高(gāo)通量(liáng)組織研磨器(qì)SCIENTZ-48L，利用(yòng)液氮(dàn)對樣品進行深度(dù)冷(lěng)凍脆化(huà)，再(zài)通過(guò)高(gāo)頻垂直(zhí)振蕩(dàng)驅動(dòng)研磨(mó)珠高速撞擊，以實(shí)現酵母細胞(bāo)的高效(xiào)物(wù)理破碎。整個過(guò)程(chéng)在(zài)低溫環(huán)境下(xià)進(jìn)行，能(néng)盡可能(néng)的保護(hù)核(hé)酸，蛋(dàn)白(bái)質等(děng)生(shēng)物(wù)大分(fēn)子的(dí)活性，為後(hòu)續(xù)分(fēn)析(xī)提供高(gāo)質(zhì)量的均質化裂解(jiě)物(wù)。

　　傳統(tǒng)研磨方法存在(zài)的(dí)痛點：

　　△細胞壁堅(jiān)韌難(nán)破：酵(jiào)母細胞(bāo)壁厚(hòu)實(shí)，常規(guī)渦(wō)旋振(zhèn)蕩或手(shǒu)工研(yán)磨難(nán)以(yǐ)達到高破(pò)壁(bì)率，直接影響(xiǎng)胞內產(chǎn)物得(dé)率。

　　△生物分(fēn)子易降(jiàng)解：研磨過(guò)程中產(chǎn)生(shēng)的摩擦(cā)升(shēng)溫(wēn)易(yì)使(shǐ)RNA，熱敏(mǐn)蛋(dàn)白及代(dài)謝物(wù)失(shī)活或(huò)降(jiàng)解(jiě)，影響下遊檢測(cè)準確性(xìng)。

　　△處理通量低且不(bù)均一(yī)：傳統方法(fǎ)單(dān)次(cì)處理(lǐ)樣品(pǐn)量少，批(pī)次間(jiān)破壁效(xiào)率(shuài)差異大(dà)，難(nán)以(yǐ)滿足高通(tōng)量或(huò)重(zhòng)復性(xìng)要求高的實驗(yàn)設(shè)計(jì)。

　　△樣品(pǐn)易產生泡(pào)沫或(huò)氣(qì)溶膠(jiāo)：含(hán)去垢劑(jì)的(dí)裂解液(yè)在振(zhèn)蕩中易產生(shēng)泡沫(mò)，影響(xiǎng)處理效果並(bìng)增加(jiā)交(jiāo)叉汙染風險(xiǎn)。

　　實驗準備：

　　實驗(yàn)樣(yàng)品：釀酒(jiǔ)酵母(mǔ)濕菌(jūn)體(tǐ)（新鮮培養(yǎng)後(hòu)離心收集）或凍幹菌粉

　　實驗目的：驗證SCIENTZ-48L研磨(mó)器在(zài)液氮冷凍與(yǔ)高頻(pín)振(zhèn)蕩(dàng)條件下，能(néng)否高效破碎(suì)釀(niàng)酒酵母(mǔ)細胞壁，獲(huò)得(dé)破(pò)壁充分，均(jūn)質(zhì)化(huà)的裂解物(wù)，滿足(zú)總RNA/蛋(dàn)白質提(tí)取(qǔ)，酶活性測定(dìng)及代(dài)謝組學分析等(děng)後續應(yīng)用(yòng)需求(qiú)。

　　實驗耗(hào)材：

　　研磨(mó)管：2ml離心(xīn)管。

　　研磨珠：石(shí)英砂（40-70目）(如(rú)使(shǐ)用(yòng)研(yán)磨珠推薦氧化鋯(gào)材質，耐磨(mó)且汙(wū)染(rǎn)極微(wēi))。

　　其他：液(yè)氮，裂解(jiě)緩衝液(可(kě)選，如PBS，Tris-HCl或(huò)含蛋白酶(méi)/RNase抑(yì)製(zhì)劑(jì)的(dí)專(zhuān)用裂(liè)解(jiě)液)。

　　實驗(yàn)設(shè)備：

　　設備(bèi)名稱(chēng)：新芝(zhī)生物冷凍(dòng)型高通(tōng)量(liáng)組織(zhī)研(yán)磨器(qì)SCIENTZ-48L

　　核(hé)心(xīn)優勢(shì)：設備(bèi)具備原位(wèi)冷凍功(gōng)能，溫度控製範(fàn)圍可(kě)達-50℃至(zhì)25℃，並支持編(biān)程(chéng)控製研(yán)磨時間，頻率，循(xún)環次(cì)數(shù)等參(cān)數(shù)，確保實(shí)驗條件的(dí)高度可(kě)重(zhòng)復性(xìng)。

　　實驗步驟：

　　樣品(pǐn)前(qián)準(zhǔn)備(bèi)(冷凍脆(cuì)化(huà))：

　　取適(shì)量(liáng)新(xīn)鮮(xiān)培(péi)養的(dí)酵(jiào)母濕(shī)菌體(建議0.2-0.5g，或(huò)凍幹(gān)菌粉(fěn)0.1-0.2g)，置(zhì)於離心(xīn)管(guǎn)中。

　　加(jiā)入石英(yīng)砂（40-70目(mù)）(覆(fù)蓋菌(jūn)體表麵即可(kě))。

　　關(guān)鍵步(bù)驟：向(xiàng)研(yán)磨管(guǎn)中倒入液氮(dàn)，浸(jìn)泡(pào)樣品至(zhì)少(shǎo)60秒，使其(qí)充(chōng)分(fēn)冷凍脆化。冷凍後等液(yè)氮揮發再加入(rù)蛋(dàn)白裂(liè)解(jiě)液(yè)體(tǐ)。對於(yú)濕(shī)菌體(tǐ)，建議進行2-3次“液(yè)氮速凍(dòng)-室(shì)溫(wēn)融化”的凍(dòng)融循環，可顯著提升(shēng)後(hòu)續破(pò)壁效(xiào)率。

　　若後(hòu)續(xù)進(jìn)行(háng)RNA或蛋(dàn)白(bái)提取(qǔ)，可在(zài)此步同步加入適(shì)量裂(liè)解緩衝(chōng)液(總體(tǐ)積不超(chāo)過(guò)研(yán)磨管(guǎn)容(róng)量的(dí)1/2)。

　　參(cān)數設(shè)置(zhì)：

　　將(jiāng)裝有(yǒu)樣(yàng)品(pǐn)的(dí)適(shì)配器(qì)嚴格配(pèi)平後(hòu)裝(zhuāng)入研磨器，鎖緊艙門(mén)。

　　研磨(mó)頻(pín)率：60Hz。

　　單次(cì)運(yùn)行時(shí)間：60秒(短(duǎn)時高(gāo)頻(pín)能有效控製升(shēng)溫)。

　　循環(huán)次數(shù)：3次(cì)左右。

　　間歇暫停：每(měi)次運(yùn)行後暫停60秒，使樣(yàng)品(pǐn)充分冷(lěng)卻。

　　溫度(dù)控(kòng)製(zhì)：啟(qǐ)動(dòng)設(shè)備製(zhì)冷(lěng)係統(tǒng)，設定(dìng)研磨(mó)腔(qiāng)溫度(dù)維(wéi)持(chí)在0~4℃或更(gēng)低，防(fáng)止(zhǐ)樣(yàng)品升溫。

　　進行(háng)研磨(mó)：

　　啟(qǐ)動程(chéng)序，設備(bèi)將自(zì)動執行(háng)間歇研磨(mó)程(chéng)序。

　　研(yán)磨(mó)過程中，設(shè)備(bèi)通過(guò)夾具(jù)的(dí)垂直(zhí)振(zhèn)蕩(行程34mm)，驅(qū)動(dòng)研磨珠(zhū)對冷凍(dòng)脆化(huà)的酵(jiào)母(mǔ)細(xì)胞進行高(gāo)頻衝擊，剪切(qiē)，實現細(xì)胞壁的快速破碎。

　　結束取(qǔ)樣：

　　研磨(mó)完成後，取(qǔ)出研磨(mó)管，建(jiàn)議在(zài)冰上(shàng)短暫冷(lěng)卻(què)。

　　鏡檢(jiǎn)觀察破壁效果：可觀察到懸液(yè)由(yóu)渾濁的菌體沉(chén)澱(diàn)轉變為(wéi)均匀(yún)細膩的乳(rǔ)濁液。

　　將裂解(jiě)液(yè)在4℃下離(lí)心(如12,000 rpm，10分(fēn)鐘)，取上清即可(kě)用(yòng)於(yú)後續的(dí)核(hé)酸(suān)提(tí)取，蛋白質定(dìng)量，酶(méi)活檢測(cè)等實驗。

　　實(shí)驗(yàn)結果：

　　左：研(yán)磨前（完(wán)整酵母(mǔ)菌(jūn)體）；右：研(yán)磨(mó)後（均(jūn)質裂解物）

　　現(xiàn)象(xiàng)：經(jīng)研(yán)磨(mó)後(hòu)，酵母濕(shī)菌(jūn)體由致(zhì)密的(dí)沉澱物轉變為均(jūn)匀(yún)細膩的乳(rǔ)濁(zhuó)裂解液(yè)，無肉(ròu)眼(yǎn)可見(jiàn)菌體(tǐ)團塊。

　　效果：顯微(wēi)鏡下(xià)觀察，可見(jiàn)完整酵(jiào)母細胞形態消失(shī)，出現(xiàn)大量(liáng)細(xì)胞碎片。鏡檢(jiǎn)估算(suàn)破(pò)壁(bì)率(shuài)可達90%以上(shàng)，與傳統(tǒng)低溫研磨(mó)方法報道(dào)的效(xiào)率一致(zhì)。

　　質量：後續檢(jiǎn)測(cè)表明，所得(dé)裂(liè)解液中的可溶(róng)性蛋(dàn)白濃(nóng)度顯著高(gāo)於傳(chuán)統渦(wō)旋法(fǎ)，總(zǒng)RNA完整性(RIN值) 良好(hǎo)，酶活(huó)性保留充(chōng)分(fēn)，完全(quán)滿足qRT-PCR，Western Blot，酶(méi)活(huó)測定(dìng)及代謝(xiè)組(zǔ)學分析等(děng)下遊(yóu)實驗(yàn)要(yào)求。

　　注(zhù)意(yì)事項：

　　◆液氮(dàn)操(cāo)作安全(quán)：液氮屬於(yú)低溫介(jiè)質(zhì)，操作(zuò)必須佩戴防凍手套和護(hù)目鏡，避(bì)免皮(pí)膚直接(jiē)接(jiē)觸(chù)液氮或(huò)低(dī)溫金(jīn)屬(shǔ)部件。操作應在(zài)通風良好(hǎo)的區域進(jìn)行(háng)，防(fáng)止氮氣積(jī)聚導(dǎo)致(zhì)缺氧。

　　◆樣品裝(zhuāng)載量：樣(yàng)品(pǐn)與研磨(mó)珠的(dí)總體積(jī)不(bù)得超(chāo)過(guò)研磨(mó)管容(róng)量的(dí)1/2，必須為研磨(mó)珠(zhū)的(dí)運動預留充足空間，以保證破碎效果。

　　◆設備配(pèi)平：設備運(yùn)行(háng)前(qián)，務(wù)必(bì)嚴(yán)格對(duì)稱配(pèi)平適配(pèi)器，防止(zhǐ)高頻(pín)振動(dòng)下設(shè)備損壞(huài)。

　　◆防(fáng)止(zhǐ)樣(yàng)品汙染與降解：開(kāi)啟(qǐ)研(yán)磨(mó)管時(shí)，建(jiàn)議(yì)在潔(jié)淨工作(zuò)台內(nèi)操作。研(yán)磨後粉(fěn)末（裂解物）應迅速加入緩(huǎn)衝(chōng)液處理(lǐ)，避免(miǎn)蛋(dàn)白(bái)質降解或(huò)氧(yǎng)化(huà)。

　　◆參數優化：對於不(bù)同(tóng)菌(jūn)株(zhū)或(huò)處理(lǐ)目的(如(rú)提(tí)取對(duì)溫度(dù)更敏感(gǎn)的(dí)RNA)，可適當降(jiàng)低(dī)研(yán)磨(mó)頻率(如(rú)50Hz)，增(zēng)加循環次(cì)數，或延長間歇(xiē)冷卻時(shí)間(jiān)。

　　實(shí)驗結論：

　　實驗(yàn)結(jié)果表(biǎo)明(míng)，新(xīn)芝生(shēng)物(wù)冷(lěng)凍型高(gāo)通量(liáng)組織研磨(mó)器SCIENTZ-48L能夠(gòu)高(gāo)效破碎(suì)釀酒酵母等細(xì)胞壁堅韌的微(wēi)生物。該方法利用液氮冷(lěng)凍有(yǒu)效脆化樣品(pǐn)，結合(hé)設(shè)備精確(què)的(dí)低(dī)溫控製與(yǔ)高頻(pín)振(zhèn)蕩(dàng)，解決了傳(chuán)統方(fāng)法產熱(rè)降解和(hé)處(chǔ)理不(bù)均(jūn)的(dí)核(hé)心(xīn)問題。該方(fāng)案(àn)操作標準(zhǔn)化，通量(liáng)高，重復性好(hǎo)，顯(xiǎn)著(zhù)提升(shēng)了(liǎo)微生(shēng)物樣(yàng)品(pǐn)前(qián)處理(lǐ)效率(shuài)與(yǔ)質(zhì)量，在分(fēn)子生物(wù)學，發酵工程(chéng)，合成生物學及藥物篩選等(děng)領(lǐng)域具有(yǒu)廣泛(fàn)的應用價值(zhí)。