實驗背(bèi)景

　　對分枝(zhī)杆(gān)菌來(lái)說，因細(xì)胞(bāo)壁結構特(tè)殊(shū)，阻礙了其在(zài)人(rén)和(hé)動物結核病(bìng)診(zhěn)斷(duàn)上的(dí)應(yīng)用。選取已報道的布魯氏(shì)菌和結(jié)核(hé)分(fēn)枝杆菌(jūn)16sRNA探(tàn)針(zhēn)，通過改(gǎi)進樣品處(chǔ)理(lǐ)方式(shì)
，優化雜交(jiāo)條件(jiàn)，進一(yī)步簡化(huà)操作步驟(zhòu)，同(tóng)時利用本(běn)實(shí)驗室保(bǎo)存的菌(jūn)株和組織(zhī)樣(yàng)品，對(duì)探針的特(tè)異性進(jìn)行評價，最終建立(lì)了一個快(kuài)速
，準確的(dí)“兩(liǎng)病”熒光原(yuán)位(wèi)雜(zá)交診(zhěn)斷方法(fǎ)。

實(shí)驗步驟

　　將冷(lěng)凍(dòng)保存(cún)的布魯(lǔ)氏菌(jūn)株接(jiē)種(zhǒng)於(yú)布魯氏(shì)菌(jūn)液(yè)體(tǐ)培養基(jī)(BBL)，37℃培養(yǎng)2d;牛
，禽(qín)結核(hé)分枝(zhī)杆(gān)菌接種於(yú)羅氏培養基，37℃培(péi)養4周;回收培養(yǎng)物，PBS洗一遍，然後加(jiā)入1% PFA溶液，混匀，4℃冰箱(xiāng)過(guò)夜。以上操作須在生(shēng)物安(ān)全(quán)三級(jí)實驗(yàn)室進(jìn)行(háng)，FPA固定後(hòu)的步驟(zhòu)可在生(shēng)物安全二(èr)級實驗室進(jìn)行(háng)。

　　將固(gù)定後的(dí)菌液(yè)用PBS洗(xǐ)兩(liǎng)遍，然後塗(tú)布(bù)於載玻片上，風幹待(dài)檢。對(duì)布(bù)魯(lǔ)氏菌(jūn)，依次在30%
，70%
，100%乙醇(chún)中處理5 min，然(rán)後(hòu)置陰涼(liáng)處(chǔ)自(zì)然風幹;加200μL雜(zá)交液，45℃雜(zá)交(jiāo)1.5~4h;用44℃預熱(rè)的洗滌液洗滌(dí)2 min，雙蒸水(shuǐ)衝(chōng)洗後，滴(dī)加(jiā)抗熒(yíng)光(guāng)淬滅(miè)封(fēng)片(piàn)劑，鏡(jìng)檢。對(duì)牛(niú)結(jié)核分枝(zhī)杆(gān)菌(jūn)，把樣品(pǐn)在(zài)二甲苯中(zhōng)作用10~20 min後(hòu)，依(yī)次在(zài)100%
，70%
，30%乙(yǐ)醇(chún)和(hé)PBS緩(huǎn)衝液(yè)中處理5min，用(yòng)溶菌酶(méi)(1mg/mL)和消色肽(tài)酶(30U/mL)消(xiāo)化(huà)20min，然(rán)後分別在(zài)PBS以及30%
，70%
，100%乙(yǐ)醇(chún)中處(chǔ)理5min，風幹;滴加(jiā)雜(zá)交液，使用分子雜(zá)交爐(lú)(LF-IIIA，寧(níng)波新(xīn)芝(zhī))於(yú)45℃雜(zá)交4 h，用37℃預(yù)熱(rè)的洗(xǐ)滌(dí)液(yè)洗(xǐ)滌(dí)20min，最後封(fēng)片鏡檢(jiǎn)。對組織研磨液，短(duǎn)暫離心，取(qǔ)上清(qīng)，PFA固(gù)定後塗片。對(duì)痰(tán)液樣(yàng)品，先(xiān)塗(tú)片，再用PFA固定(dìng)，雜(zá)交過(guò)程與上(shàng)相(xiāng)同。

實驗(yàn)結果

布魯(lǔ)氏(shì)菌(jūn)‍‍‍：雜交(jiāo)前，對(duì)布(bù)魯氏菌(jūn)無(wú)需(xū)特(tè)別處(chǔ)理，45 ℃雜交(jiāo)1.5 h即出(chū)現紅(hóng)色(sè)熒光信(xìn)號(hào)，200倍放大下觀(guān)察，清晰可見(jiàn)(圖(tú)1-A
，B)。雜交3 h可完(wán)全(quán)滿(mǎn)足(zú)檢測(cè)需要，延長時間(jiān)至8 h或12 h，信號(hào)強(qiáng)度(dù)不(bù)會(huì)明(míng)顯增加(jiā)，因而(ér)布魯(lǔ)氏(shì)菌(jūn)熒光原位雜交簡(jiǎn)便(biàn)
，快(kuài)速，可(kě)在(zài)4 h內(nèi)完成。Bru-996探(tàn)針與(yǔ)布魯氏(shì)菌(jūn)S2
，A19
，Rev.1疫苗(miáo)株(zhū)和(hé)HN6
，XJ-1分離(lí)株(zhū)，均產生雜(zá)交信(xìn)號，在牛(niú)結核分枝杆菌
，禽(qín)結(jié)核分枝(zhī)杆(gān)菌(jūn)和(hé)大腸杆菌中沒有觀察到(dào)熒光信號，表(biǎo)明(míng)該探(tàn)針(zhēn)具有較高的特異性(xìng)。從(cóng)5個已(yǐ)知布魯(lǔ)氏菌(jūn)病羊(yáng)組(zǔ)織病料(liào)(2個肝(gān)髒(zàng)
，2個(gè)脾(pí)髒
，1個胎盤)中均成功檢測到(dào)布(bù)魯(lǔ)氏(shì)菌(圖(tú)1-C)，證明(míng)該(gāi)方法具有(yǒu)較高(gāo)的敏感性。在高倍(bèi)放大下(xià)觀察，布魯(lǔ)氏(shì)菌呈(chéng)短杆菌(jūn)，小(xiǎo)於大(dà)腸(cháng)杆(gān)菌(圖1-D)。

牛(niú)結(jié)核分歧杆菌(jūn)‍‍‍牛結(jié)核分枝杆菌樣品(pǐn)雜(zá)交(jiāo)前(qián)，須用(yòng)二(èr)甲(jiǎ)苯(běn)和溶(róng)菌(jūn)酶處(chǔ)理（也可(kě)使用(yòng)消(xiāo)色肽(tài)酶，但非必須），二(èr)者缺(quē)一不可。二(èr)甲苯需處理至少(shǎo)20 min，溶菌(jūn)酶需消化(huà)30 min，以充分(fēn)去(qù)除表(biǎo)麵的(dí)酸類物(wù)質，從而獲(huò)得(dé)充(chōng)分(fēn)的通(tōng)透性(xìng)，便於(yú)探(tàn)針進(jìn)入並與RNA雜交。45 ℃雜交4 h，可獲得最佳效果，縮短(duǎn)雜交時間會(huì)影響信號(hào)強度。因此(cǐ)，牛(niú)結核分枝(zhī)杆(gān)菌的檢(jiǎn)測時(shí)間(jiān)較長，需(xū)6~8 h。從牛肺髒(zàng)結核結(jié)節(jié)研(yán)磨液上清中，成(chéng)功(gōng)檢測(cè)到(dào)牛(niú)分枝杆菌（圖2-A），經(jīng)抗酸(suān)染色檢(jiǎn)出較(jiào)多(duō)的抗酸菌(jūn)（圖(tú)2-B）。結核病陽(yáng)性牛(niú)鼻腔拭子中，未檢(jiǎn)出(chū)典型的牛(niú)結核分(fēn)枝杆菌。

　　本研究建立(lì)了(liǎo)布魯氏菌與結核分(fēn)枝杆菌(jūn)的熒光原位(wèi)雜交(jiāo)快速檢(jiǎn)測方法。針對布(bù)魯(lǔ)氏菌優化後實現4小時精準(zhǔn)檢測，Bru-996探針特(tè)異(yì)性強，可檢出臨床(chuáng)組(zǔ)織樣本中病原體;牛結核分枝杆菌(jūn)通(tōng)過(guò)二(èr)甲苯脫(tuō)脂(zhī)與酶解預處理突(tū)破細(xì)胞(bāo)壁屏障，6-8小時(shí)完成(chéng)檢測(cè)，與抗(kàng)酸染(rǎn)色結果(guǒ)一致。該(gāi)方(fāng)法(fǎ)操作(zuò)安全高效(xiào)，為(wéi)布魯(lǔ)氏菌(jūn)病(bìng)和(hé)結核病(bìng)的臨(lín)床診斷(duàn)提供了(liǎo)可靠技(jì)術支撐。