酵(jiào)母(mǔ)菌是(shì)發酵(jiào)工(gōng)業，基因(yīn)工(gōng)程(chéng)及(jí)基礎(chǔ)生物(wù)學研(yán)究中廣泛使用(yòng)的模式微生(shēng)物(wù)。在蛋白(bái)質(zhì)提取(qǔ)，核酸(suān)純(chún)化，細胞器分(fēn)離及(jí)代謝物(wù)分析等實驗中，需高效破壁(bì)以釋(shì)放胞(bāo)內(nèi)物(wù)質。然而，酵母(mǔ)菌細(xì)胞壁(bì)厚(hòu)實(shí)，含(hán)葡(pú)聚(jù)糖和甘(gān)露聚糖(táng)等復雜多糖(táng)結構(gòu)，化(huà)學裂解(jiě)或酶(méi)解法(fǎ)耗(hào)時且易(yì)引(yǐn)入(rù)幹(gān)擾(rǎo)，傳(chuán)統機械(xiè)研磨(mó)(如玻璃珠渦旋(xuán))處理通量(liáng)低(dī)，重(zhòng)現性(xìng)差(chà)。本(běn)實驗(yàn)采(cǎi)用新芝生物(wù)高通量組織(zhī)研磨器SCIENTZ-48L對酵(jiào)母(mǔ)菌濕菌(jūn)體進行濕(shī)磨處(chǔ)理，驗證其(qí)在(zài)低溫條(tiáo)件(jiàn)下高(gāo)效破碎酵(jiào)母細胞的(dí)能力，獲得(dé)均質化(huà)裂解(jiě)物，滿足(zú)分(fēn)子生物學(xué)與生化(huà)分析(xī)需求。

傳(chuán)統研磨(mó)方(fāng)法存在的痛(tòng)點(diǎn)：

　　▲細胞壁堅韌(rèn)難(nán)破：酵(jiào)母細胞壁(bì)結(jié)構(gòu)致密，常規渦旋(xuán)振蕩(dàng)或手工研(yán)磨(mó)難(nán)以(yǐ)達到高(gāo)破(pò)壁率(shuài)，影響(xiǎng)胞(bāo)內產物得率。

　　▲產(chǎn)熱導(dǎo)致生(shēng)物分(fēn)子(zǐ)降解(jiě)：研磨過程中(zhōng)摩擦(cā)升(shēng)溫易使(shǐ)RNA，酶蛋(dàn)白(bái)及代謝物失活(huó)，尤(yóu)其對(duì)熱敏感的實驗(yàn)影響顯(xiǎn)著(zhù)。

　　▲泡沫(mò)與(yǔ)氣溶膠問題：含(hán)表麵(miàn)活性劑的(dí)裂解液在(zài)振(zhèn)蕩中易產生泡沫(mò)，影(yǐng)響樣品處理(lǐ)效(xiào)果並增(zēng)加汙染風(fēng)險(xiǎn)。

　　▲處理(lǐ)通量(liáng)低且不(bù)均(jūn)一：渦旋儀一(yī)次僅能處理少(shǎo)量(liáng)樣(yàng)品，多(duō)批(pī)次(cì)間(jiān)破壁效率(shuài)差(chà)異(yì)大，難(nán)以滿(mǎn)足高(gāo)通量篩選或重復(fù)性要求(qiú)高(gāo)的實驗設計。

實(shí)驗準(zhǔn)備(bèi)：

　　實(shí)驗樣品：酵(jiào)母菌濕菌體(tǐ)(酵母新鮮培養(yǎng)後離心收集(jí))

　　實(shí)驗(yàn)目的(dí)：驗(yàn)證(zhèng)新(xīn)芝生物高(gāo)通量(liáng)組(zǔ)織研(yán)磨器(qì)SCIENTZ-48L在低溫濕磨(mó)條件下(xià)，能(néng)否(fǒu)高效破碎(suì)酵(jiào)母菌細胞壁(bì)，獲得破壁(bì)充(chōng)分，均質(zhì)化的(dí)裂解物(wù)，適(shì)用(yòng)於總(zǒng)RNA提(tí)取(qǔ)，蛋(dàn)白質純化(huà)，酶(méi)活(huó)性測(cè)定及代(dài)謝(xiè)組學分(fēn)析等後(hòu)續(xù)應用(yòng)。

　　實驗(yàn)耗材：2ml離心管，6mm研磨珠(zhū)1顆(kē)，3mm研(yán)磨珠若幹(gān)，可(kě)選配裂解緩(huǎn)衝液(如含Tris-HCl，EDTA，SDS或(huò)Triton X-100的裂(liè)解液)

　　實驗(yàn)設備(bèi)：

冷凍(dòng)型高通(tōng)量組(zǔ)織研(yán)磨器SCIENTZ-48L

實驗步(bù)驟：

　　樣(yàng)本準(zhǔn)備(bèi)：樣(yàng)品(pǐn)分為三批：1—菌體(tǐ)直磨，2—200ulPBS濕(shī)磨，3—液氮(dàn)速凍幹(gān)磨(mó)。取(qǔ)新(xīn)鮮培養(yǎng)的(dí)酵母菌(jūn)液，研磨前(qián)一定要先液(yè)氮速凍(dòng)，維持(chí)五(wǔ)分鐘，等待融化，如此凍(dòng)融(róng)循環(huán)三(sān)次，再開始研(yán)磨。離(lí)心收集濕(shī)菌體，取(qǔ)0.2g的濕菌(jūn)體(tǐ)置(zhì)於離心管(guǎn)中。加(jiā)入6mm研(yán)磨珠1顆(kē)和(hé)3mm研磨(mó)珠(zhū)若幹(gān)(覆蓋菌體表麵即(jí)可(kě))。若進行(háng)RNA或蛋(dàn)白提(tí)取(qǔ)，可同步加入(rù)適量裂解(jiě)緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)(樣(yàng)品(pǐn)總(zǒng)體積不超過(guò)離心(xīn)管容1/2)。

　　參數設(shè)置：設置(zhì)研磨(mó)頻率為60Hz，單次運(yùn)行(háng)時間10–30秒(miǎo)，循環6次(每次運(yùn)行後(hòu)暫(zàn)停(tíng)30–60秒，以避免升(shēng)溫(wēn))。建議(yì)開啟設(shè)備低溫(wēn)模塊，全程維持低溫環境(jìng)。

　　進(jìn)行研(yán)磨(mó)：將(jiāng)離心(xīn)管裝入適(shì)配器，對稱(chēng)配(pèi)平(píng)後鎖緊艙門，啟動(dòng)研磨程序。設備通過(guò)高(gāo)頻垂(chuí)直振(zhèn)蕩使研磨(mó)珠高速衝(chōng)擊，剪(jiǎn)切酵母(mǔ)細胞(bāo)，實現細胞壁(bì)的快速(sù)破(pò)碎(suì)。

　　結(jié)束取樣：研(yán)磨完(wán)成後，取出離心(xīn)管，置於冰(bīng)上(shàng)。顯微鏡(jìng)下(xià)觀察可見懸液由(yóu)渾(hún)濁膏(gāo)狀(zhuàng)轉(zhuǎn)變(biàn)為(wéi)均(jūn)匀細(xì)顆粒(lì)狀或(huò)乳(rǔ)濁(zhuó)液(yè)，無肉(ròu)眼(yǎn)可見(jiàn)菌體團塊(kuài)。將裂解(jiě)液低(dī)溫(wēn)離(lí)心(xīn)後取上清(qīng)，即可(kě)用於後續(xù)提(tí)取或檢測。

實驗(yàn)結果(guǒ)：

　　顯微(wēi)鏡下(xià)左(zuǒ)：研(yán)磨(mó)前(完整(zhěng)濕菌(jūn)體沉澱(diàn));右：研磨後(hòu)(均(jūn)質化裂(liè)解(jiě)物(wù))

　　經(jīng)高(gāo)通量組(zǔ)織研(yán)磨(mó)器(qì)SCIENTZ-48L處(chǔ)理(lǐ)後，如圖(tú)樣(yàng)品液氮(dàn)速(sù)凍(dòng)研磨後有(yǒu)明(míng)顯變化(huà)，酵母濕菌體由致(zhì)密沉澱(diàn)物(wù)轉(zhuǎn)變為均匀(yún)細膩的(dí)乳(rǔ)濁(zhuó)裂(liè)解液，顯(xiǎn)微鏡下(xià)真菌(jūn)密度下(xià)降，樣(yàng)品濕磨後得到(dào)起泡沫的濁液，此(cǐ)現(xiàn)象(xiàng)為菌(jūn)液(yè)內部(bù)的(dí)蛋(dàn)白質釋(shì)放(fàng)所導致。後續檢測表(biǎo)明(míng)，總RNA得(dé)率和完整(zhěng)性(RIN值)良好(hǎo)，可(kě)溶性蛋白濃(nóng)度顯著(zhù)高於傳統渦(wō)旋法(fǎ)，酶活性(xìng)保(bǎo)留(liú)充(chōng)分(fēn)，滿足分子生(shēng)物學(xué)及生(shēng)化分析(xī)要求。

注意事(shì)項：

　　◆液氮(dàn)速凍至關(guān)重要(yào)：一定(dìng)要(yào)先(xiān)液氮速凍(dòng)，維持五分鐘(zhōng)，等融(róng)化(huà)，這樣凍融循環三次，再(zài)開(kāi)始研磨。

　　◆低(dī)溫控(kòng)製同(tóng)樣重要：酵母破(pò)壁易(yì)產(chǎn)熱，必須(xū)開(kāi)啟設備(bèi)冷(lěng)凍功(gōng)能(néng)或使用(yòng)預(yù)冷研(yán)磨(mó)，同時(shí)采用間(jiān)歇(xiē)程序，確保RNA和蛋白(bái)不受(shòu)降解。

　　◆菌(jūn)體量不宜過(guò)多：濕菌體與研磨珠總(zǒng)體積控製在管容的1/2以內，保證(zhèng)珠(zhū)體有(yǒu)足夠運動空(kōng)間，避免(miǎn)破(pò)壁(bì)不(bù)均。

　　◆裂解(jiě)液選擇(zé)：根據後(hòu)續(xù)實驗(RNA，蛋白或(huò)代謝(xiè)物)選用合適(shì)緩衝液(yè)，可添加蛋白(bái)酶抑(yì)製(zhì)劑(jì)或(huò)RNase抑(yì)製劑。含高濃度變性劑(如(rú)胍鹽(yán))的裂(liè)解液(yè)能輔(fǔ)助破壁(bì)並快(kuài)速(sù)滅活核酸酶。

　　◆泡沫抑(yì)製：若(ruò)裂解液含去垢劑，運行後可靜(jìng)置片刻或低(dī)速離心消泡，避(bì)免影(yǐng)響移(yí)液操作。

　　◆設(shè)備(bèi)配(pèi)平：運(yùn)行前(qián)務必對(duì)稱(chēng)配(pèi)平適配器(qì)，防止高(gāo)速振蕩時(shí)不平衡(héng)導致設(shè)備(bèi)損傷。

　　◆樣品保存：研磨後的裂解物應立即進(jìn)行(háng)後續(xù)處理(lǐ)或凍存，避(bì)免(miǎn)目(mù)標(biāo)分子降(jiàng)解(jiě)。

實驗結(jié)論：

　　實(shí)驗結(jié)果表(biǎo)明(míng)，新(xīn)芝(zhī)生物高通量組織研磨器SCIENTZ-48L能夠高(gāo)效處理酵母菌濕菌體(tǐ)這類細胞壁堅(jiān)韌(rèn)的(dí)微生物(wù)樣(yàng)品(pǐn)，在低溫濕磨條件(jiàn)下實現(xiàn)細(xì)胞(bāo)壁(bì)充(chōng)分(fēn)破碎，獲(huò)得(dé)均(jūn)質(zhì)化(huà)裂(liè)解物(wù)，高效保(bǎo)留(liú)核酸，蛋(dàn)白(bái)質及(jí)代(dài)謝物活性(xìng)。該方(fāng)法(fǎ)操(cāo)作簡便(biàn)，通量(liáng)高，重(zhòng)復性好，有(yǒu)效避(bì)免(miǎn)了傳統(tǒng)方(fāng)法(fǎ)中(zhōng)產熱降(jiàng)解和(hé)處(chǔ)理(lǐ)不(bù)均的(dí)問題(tí)，顯著提(tí)升了微(wēi)生(shēng)物樣品前處理效率(shuài)與(yǔ)質量(liáng)，適用(yòng)於(yú)分子生物(wù)學，發酵工(gōng)程，合成(chéng)生(shēng)物(wù)學及藥物(wù)篩選等領域的樣(yàng)品製(zhì)備(bèi)環(huán)節(jié)。